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Congresso Brasileiro de Microbiologia 2023
 		Resumo: 1295-1

1295-1

UM PROTOCOLO SIMPLIFICADO PARA ISOLAMENTO DE BACTERIOFAGOS BACTERIOLÍTICOS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS DE RIOS E LAGOS URBANOS

Autores:
Elisabete Vicente (ICB/USP - INSTITUTO CIÊNCIAS BIOMÉDICAS/USP, DEP. DE MICROBIOLOGIA ) ; Regina Simionato (ICB/USP - INSTITUTO CIÊNCIAS BIOMÉDICAS/USP, DEP. DE MICROBIOLOGIA ) ; Rita Café (ICB/USP - INSTITUTO CIÊNCIAS BIOMÉDICAS/USP, DEP. DE MICROBIOLOGIA )

Resumo:
Bacteriófagos são vírus bacterianos. Alguns seguem o ciclo de vida lisogênico e outros que seguem o ciclo lítico. A estratégia de usar fagos bacteriolíticos em terapia humana ou animal (fagoterapia) e para o controle de pragas de plantas é vista atualmente como uma abordagem promissora para tratar infecções causadas por bactérias resistentes a muitos antibióticos (“multidrug resistant” - MDR)). Os bacteriófagos só podem infectar células bacterianas, somente dentro delas podem se replicar e estão intimamente relacionados às bactérias que podem infectar. O objetivo desse trabalho é a apresentar de um método de simples execução e baixo custo para utilizar nas aulas práticas de graduação e/ou ensino médio. A metodologia utilizada foi a coleta de 50 ml de amostras de água de pequenos lagos ou rios localizados em áreas urbanas. Para isolamento dos fagos, foi utilizado um protocolo previamente descrito com algumas modificações. (i) Mistura amostra de água/bactéria – As amostras de água, sem qualquer tratamento, foram mantidas à temperatura ambiente, sem agitação, por 5-10 min, para sedimentação de resíduos. Em condições assépticas e cuidadosamente, dentro de um tubo esterilizado foram coletados: 10 ml de cada amostra de água, 2 ml de uma cultura bacteriana (E. coli C600 pré-cultivada em meio LB a 37ºC por 16 h), e 5 ml de LB Medium-5X (também pode ser utilizado outro meio de cultura apropriado); (ii) Tempo de incubação para o enriquecimento do número das partículas virais - As misturas foram incubadas a 37ºC em estufa por períodos curtos de tempo (20 min, 1-2 horas) ou por um longo período (24 h). Após a incubação, cada mistura foi coletada em seringa e filtrada passando através de uma membrana Millipore 0,22 um. O filtrado (50-500 uL) foi coletado em microtubo diluído de forma seriada (20 µl em 180 µl de água estéril): Não-diluído-ND, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5). (iii) Para visualização das placas de lise dos fagos - em um tubo contendo 3ml de “soft-ágar “(LB + ágar 0,70%) a 45ºC foram adicionados: 100 uL de cultura bacteriana ( C600 pré-cultivada em meio LB a 37ºC por 16 h/107 células) e 100 uL da diluição do filtrado. A mistura foi rapidamente agitada girando o tubo entre as palmas das mãos e o conteúdo foi despejado em uma placa contendo meio sólido LA. Após a solidificação do “overlay” de “soft-ágar”, as placas foram incubadas a 37ºC por 16-24 h. Foi feita análise visual das placas visando observar a existência de placas de lise (áreas redondas claras na superfície do meio de cultura sólido). Cada placa de lise isolada deriva da infecção inicial de “uma-única-partícula-fágica” (“unidade formadora-de-placa”, PFU). Como resultado, obteve-se sucesso no isolamento de PFUs provenientes de várias amostras de água. O número de PFUs obtido aumenta com o aumento do tempo de incubação durante o enriquecimento das partículas fágicas. Maior número de PFU foi obtido quando a etapa de incubação de enriquecimento de fagos foi realizada por 24 h. Cerca de 100 PFUs foram obtidas a partir da diluição 10-4 de alguns destes filtrados. O método apresentado é de simples execução e baixo custo, não requer o uso de solventes tóxicos ou de equipamentos sofisticados e permite a obtenção de placas de lise de bacteriófagos. Águas provenientes de rios e lagos urbanos pesquisados contêm bacteriófagos em altas concentrações. Provavelmente estes fagos desempenham um importante papel no equilíbrio da população bacteriana nessas águas.

Palavras-chave:
 vírus de bactérias, bacteriófagos, agentes bacteriolíticos, fagoterapia, controle biológico, agentes antibacterianos alternativos


Agência de fomento:
CAPES